前言

“国际肝病-肝脏血管病专栏”是北部战区总医院消化内科祁兴顺医生应《国际肝病》编辑部邀请联合发起的学术专栏，定期收集整理肝脏血管病领域的研究进展，每两周（周三）挑选一篇重要文献进行精读讨论，希望能帮助读者知其然知其所以然，启迪临床科研思维、学以致用。

文章简述

肝硬化会严重影响门静脉系统（PVS），导致门静脉高压（PHT）、侧支循环形成和门静脉血栓（PVT）形成，增加肝病患者的死亡率。尽管肝硬化和PHT的肝内血管变化已被广泛研究，但人类门静脉血管的研究因门静脉组织难以获取及临床前模型存在不足而受限。现有PHT动物模型无法完全模拟人类肝硬化缓慢进展的特征及代谢、肥胖、酒精使用和感染等复杂因素对疾病的影响；此外，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和肝窦内皮细胞等替代模型不能完全反映肝外PVS内皮细胞的独特生理病理特征。

JHEP Reports杂志于2025年7月正式发表了一篇题为《人门静脉内皮细胞的分离和永生化：一种用于研究内脏血管系统的新型工具》的文章。本研究旨在通过分离、鉴定并永生化人门静脉内皮细胞（PVECs），以加深对肝脏疾病病理生理变化的理解，并为未来的药物检测建立平台。

Anton等成功从人门静脉组织分离出的PVECs具有典型内皮细胞形态（鹅卵石状），表达CD31、CD144及其他内皮细胞标志物，并具备血管生成能力。PVECs表现出与下腔静脉内皮细胞（ICVECs）不同的转录组学特征，丰富了血管重构和应激反应的途径。原代PVECs在6-9代后出现衰老，永生化门静脉内皮细胞（iPVECs）在传代至30-40代时，仍保留内皮标志物表达和功能特性，且转录组特征与原代PVECs高度一致。

综上，iPVECs在永生化后仍保留门静脉内皮细胞特异性，克服了现有PVECs模型的关键局限性，并为研究肝硬化PHT等内脏血管疾病提供了新工具。

重要研究结果分析及临床意义

1. 人门静脉组织内皮细胞的分离

（图源自文献）

收集肝移植术中新鲜门静脉或下腔静脉组织标本，分离并培养其组织细胞。通常在10天内，观察到组织细胞汇合成单层细胞。其中，内皮细胞（ECs）呈集落生长，间质细胞呈现向ECs集落周围排列生长趋势（图A）。使用流式细胞术（FACS）纯化ECs，得到CD31和CD144双阳性的内皮细胞并将其接种到纤维连接蛋白包被的培养皿上。纯化后，PVECs培养物最初表现为均匀的鹅卵石形态且分布为小而紧密聚集的增殖群落（图B），最终生长为均匀的单层ECs（图C）。PVECs在培养基中约能生长增殖60天。在传代6-9代时，PVECs开始表现出以细胞变大、变平且出现多核及细胞质颗粒为特征的衰老表型（图D）。在传代7-9代时，细胞停止增殖（图E）。

2. PVECs的内皮特性验证

（图源自文献）

免疫细胞化学证实PVECs中存在内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和血管性血友病因子（vWF）两种标志性内皮蛋白的膜表达（图F）。为评估血管生成潜能，在基质上培养PVECs，并监测其血管形成情况，发现PVECs在4小时内形成管状结构，24小时生长为成熟血管。这种生长潜能可持续到第6代细胞（图G）。定量反转录PCR （qRT-PCR）显示，PVECs表现出与ICVECs和HUVECs类似的内皮标志物表达水平，且均高于非ECs部分；而非ECs则高表达间充质标志物（图H）。同时，PVECs表现出与ICVECs和HUVECs类似的血管活性和凝血分子表达水平，如一氧化氮合酶3（NOS3）、内皮素1（EDN1）、SERPINE1、组织型纤溶酶原激活剂（PLAT）和血栓素A合酶1（TBXAS1）（图J）。PVECs还表达粘附分子（ICAM1和SELL）与血管生成因子（KDR和ANGPT2）（图K），证明其内皮功能强大。

3. PVECs与其他部位的ECs存在转录组学差异

（图源自文献）

转录组测序显示，组织细胞样本倾向于根据血管起源区域聚集（图A）。鉴定PVECs和ICVECs的差异表达基因，发现PVECs中包含164个显著上调基因和69个显著下调基因。通过途径富集分析，发现PVECs上调了与生物合成、发育可塑性、结构重塑、血管修复、应激反应和免疫相关的基因表达，以抵抗机械损伤，促进组织修复和血管止血（图B）。通过评估静脉标志物神经纤毛蛋白（NRP2）在不同细胞类型中的表达，证实了PVECs的静脉特性，NRP2在PVECs和ICVECs中均高表达，但在动脉细胞系中表达极低（图C）。动脉内皮细胞特异性标志物（EPHB2）和淋巴内皮细胞特异性标志物（PROX1）在PVECs和ICVECs中表达均较低（图D、E）。基于不同血管床来源的内皮细胞样本，分析已鉴定的差异表达基因的基因表达模式，发现ICVECs和淋巴结内皮细胞（LECs）表现出与机械排斥（Tian S, et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2022;323:H958–H974）、凝血抑制（White TA, et al. Blood 2010;116:1787）、一氧化氮调节（Chakraborty S, et al. J Biol Chem 2017;292:6600）相关基因的表达上调；动脉簇表现出与细胞迁移和血管重塑相关基因的表达上调（Li GJ, et al. Mol Med Rep 2017;15:1981; Huang J, et al. BMC Pediatr 2024;24:285）；PVECs和HUVECs表现出与转录活性和免疫活性相关基因的表达上调（图F）。这些结果突出了PVECs的功能特征，可能与门静脉独特的微环境和血管床的血流动力学相关。

4.iPVECs的生成

（图源自文献）

使用携带SV40大T抗原和GFP-嘌呤霉素耐药的融合双标记物的慢病毒颗粒转导原代PVECs，使之永生化。之后使用嘌呤霉素选择转导的细胞，并通过FACS进行GFP阳性选择（图a）；并通过qRT-PCR对SV40的表达进行测量，显示SV40仅在转导的PVECs中明确表达（图b），证明了转导的成功。PVECs在倍增11次后增速放缓，而iPVECs能保持稳定倍增超过40次（图c）。iPVECs至少可以在140天内维持内皮细胞表型和生长特征，并且始终表现出类似于原代PVECs的鹅卵石形态。iPVECs在传代25代左右开始仅出现微小的形态学变化（图d）。

5.iPVECs保留ECs的特性

（图源自文献）

FACS证实iPVECs在整个传代过程中保持了关键内皮标志物CD31和CD144的稳定表达（图A）。虽然一些内皮标记物的基因表达在第20代时有所下降（图B），但并未产生间充质标记物（图C），这表明其仍保留内皮细胞的特性。随着时间的推移，血管活性、凝血、粘附和血管生成相关的基因表达表现出一定的变异性，但一些重要的标志物仍保持稳定的表达（图D-F）。所有代际的iPVECs与原代PVECs类似，都保留了eNOS和CD36的表达。虽然观察到内皮标志物vWF存在表达降低的趋势（图G），但这种差异在蛋白质水平上没有统计学意义。ac-LDL摄取试验（Voyta JC, et al. J Cell Biol 1984;99:2034–2040; Havekes L, et al. Atherosclerosis 1985;56:81–92）表明，iPVECs各代细胞都保留了与原代PVECs相近的摄取ac-LDL能力（图H）。同样，细胞划痕实验表明，iPVECs与原代PVECs的迁移和修复损伤能力类似，具有相似的愈合率和愈合模式（图I）。这些结果表明，由于长时间培养和永生化，iPVECs存在一些基因型改变，但仍保留了关键的内皮特性，证明了它们在永生化后与ECs持续的生物学相关性。

6.iPVECs中门静脉特异性转录组表征的维持

（图源自文献）

针对PVECs和ICVECs之间的差异表达基因进行分析，发现iPVECs与PVECs表达谱密切相关（图A）。qRT-PCR证实，与ICVECs相比，iPVECs保留了原代PVECs的表达模式，这表明永生化并未显著改变iPVECs的门户特异性表达谱（图B）。在蛋白水平上，iPVECs与ICVECs同样存在差异，包括血小板-内皮相互作用（CLEC2）（图C）、内皮屏障功能（ABCB1）、细胞骨架动力学（TPM2）以及细胞外基质组装与细胞粘附（FN1）等相关基因的表达（图D）。这些发现表明，永生化后iPVECs仍能保留原代PVECs的分子和功能特征，以保证其内皮特性的表达。

总结与展望

本研究对原代PVECs系进行了永生化处理，这些iPVECs至少在35代的传代过程中，无衰老或间充质转化的迹象，从而能够产生大量的细胞库进行长期实验。同时，iPVECs维持了大多数关键内皮标志物的蛋白表达，并在传代过程中保留了原代PVECs的大部分原始特征。然而，本研究的原代PVECs均来源于肝硬化患者，其长时间的血管缺血状态会损害健康细胞活性，因此可能无法完全体现健康状态下PVECs的特征。

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无创评估食管静脉曲张模型&肝硬化预后模型

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多中心研究合作单位招募

项目（一）肝硬化门静脉血栓患病率的多中心回顾性研究单位招募

门静脉血栓（PVT），尤其是完全阻塞性PVT，可增加肝硬化患者门静脉压力，进而增加腹水、食管胃静脉曲张破裂出血的风险。当前，妥善处理肝硬化门静脉血栓仍是棘手的临床问题。另外，肝硬化PVT的患病率也尚不明确，国内更是缺乏大型流行病学研究阐明这一问题。为此，北部战区总医院消化内科牵头开展了一项全国多中心回顾性研究，基于增强CT检查结果以明确肝硬化患者PVT的患病率，并进一步回顾性分析相关危险因素。现诚挚邀请消化科、肝病科、感染科和放射科等相关专业医生参与。

项目（二）内镜时机对肝硬化伴急性静脉曲张出血患者预后影响的多中心随机对照试验研究单位招募

肝硬化患者中，急性静脉曲张出血发病率为25%-40%，6周死亡率为10%-20%。内镜检查属于有创操作，且内镜下静脉曲张治疗对操作者的技术要求高。尽管内镜检查是肝硬化伴急性静脉曲张出血的重要选择，但内镜时机对肝硬化急性静脉曲张出血患者结局的影响仍存在争议。为此，北部战区总医院消化内科牵头开展了一项国际多中心随机对照试验，现诚挚邀请具备内镜下食管胃静脉曲张出血治疗条件的相关科室医生参与。

项目（三）肝硬化显性肝性脑病输注人血白蛋白的疗效的多中心随机对照试验研究单位招募

肝硬化是慢性肝病的终末期阶段，肝硬化患者肝性脑病发生率为30-40%，且肝性脑病的一年生存率低于50%，三年生存率低于25%。其不仅严重影响肝硬化患者的预后，并且给医疗系统带来沉重的负担。输注人血白蛋白可能适用于肝硬化肝性脑病的治疗，既往研究和荟萃分析已经证明了其临床益处。然而，人血白蛋白的成本极大地影响了其在临床实践中的全面应用，临床医师常以相对较小的剂量（10-20g/d）开具人血白蛋白处方。为此，北部战区总医院消化内科牵头开展了一项多中心随机对照试验，探索是否可以通过增加人血白蛋白的输注剂量，进一步改善肝硬化肝性脑病患者的结局。现诚挚邀请消化科、肝病科、和感染科等相关专业医生参与。

项目（四）糖皮质激素治疗急性药物性肝损伤伴高胆红素血症的疗效的多中心随机对照试验研究单位招募

药物性肝损伤是指由药品、中药材、天然药物、保健品、膳食补充剂或其代谢产物、辅料、污染物、杂质等所导致的肝损伤。轻度药物性肝损伤患者可仅表现出非特异性胃肠道症状，而伴有严重高胆红素血症的患者可发展至急性肝衰竭，表现为肝功能明显恶化、黄疸、凝血功能障碍，甚至死亡。糖皮质激素可能是一种治疗的潜在手段，但其疗效及在临床实践指南的推荐价值尚存争议。为此，北部战区总医院消化内科牵头开展了一项多中心随机对照试验，以探讨糖皮质激素治疗急性药物性肝损伤伴高胆红素血症的疗效，有助于为优化药物性肝损伤的治疗方案提供高质。现诚挚邀请消化科、肝病科、和感染科等相关专业医生参与。

若您对以上任一研究项目感兴趣，可与我们联系，以获得更详细的研究信息。

联系人：

尹医生（项目一）

邮箱：yyh787659825@163.com，微信：YYH10122412

李医生（项目二、三、四）

邮箱：1208594776@qq.com，微信：lqq52708

译文作者

王彦植，北部战区总医院消化内科，大连医科大学研究生院

《国际肝病-肝脏血管病》专栏发起人及校审

祁兴顺，北部战区总医院消化内科主任，中国医科大学、沈阳药科大学、大连医科大学、锦州医科大学及辽宁中医药大学兼职硕士生导师，东北大学及中国医科大学兼职博士生导师，北部战区总医院博士后科研工作站博士后合作导师。中国科协十大代表、辽宁科协十大常委。中国抗癌协会中西整合癌前病变专委会副主任委员，中华医学会消化病学分会第十二届委员会青年学组副组长、肝胆疾病学组委员、消化血管病协作组委员，中华医学会肝病学分会肝病相关消化病协作组委员，辽宁省医学会消化病学分会第十一届委员会常委。现任BMC Gastroenterology杂志Senior Editorial Board Member、Therapeutic Advances in Gastroenterology杂志Editorial Board Member、Canadian Journal of Gastroenterology and Hepatology杂志Academic Editor、Journal of Clinical and Translational Hepatology杂志Academic Editor。2016年全军优秀博士论文获得者。入选2019年第十二届辽宁省青年科技奖十大英才、爱思唯尔2021-2024中国高被引用学者名单、2022年联勤保障部队学科中坚人才、2022年度军队高层次科技创新人才工程青年科技英才、2022年度“兴辽英才计划”青年拔尖人才。据Scopus统计，H-index为55。

（来源：《国际肝病》编辑部）

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