编者按

 

2023年6月15-17日，由全国疑难及重症肝病攻关协作组（CNSLD）、北京肝胆相照公益基金会（BIF）、北京医药科学技术发展协会（BMA）及首都医科大学附属北京佑安医院联合主办，由大连医科大学附属第二医院、佑安肝病感染病专科医疗联盟协办的“第十二届全国疑难及重症肝病大会”在景色宜人的海滨城市辽宁大连隆重召开，来自全国不同领域和学科的专家汇聚一堂，围绕目前肝病研究的进展和热点话题进行了交流。会上，北京大学医学部庄辉院士做了题为“糖组学在肝病领域的研究进展与展望”的精彩演讲。

 

糖组学对于人类生命过程和疾病 (包括肝病) 诊疗的研究中具有重要意义。庄辉院士主要介绍了糖组学的检测技术进展和寡糖链检测试剂盒——洁太司的基本原理，结合我国多中心临床研究数据，明确了糖链检测可用于肝细胞癌（HCC）的早期诊断以及显著肝纤维化和肝硬化的辅助诊断。

 

一、什么是糖组学

 

基因转录、翻译为蛋白质，蛋白质经修饰后成为糖蛋白。糖基化（Glycosylation）是最常见的蛋白质翻译后修饰之一，大多数蛋白质都需要经过糖基化修饰，连接上糖链形成糖蛋白而行使功能。人血清中50%的蛋白质都连接了糖链，糖链是除核酸和蛋白质之外的“第三条生命链”。基因组（Genome）、蛋白质组（Proteome）、糖组（Glycome）从三个不同的维度，解读生命活动。糖组学（Glycomics）是研究糖链结构和功能的一门学科（见图1）。

 

图1. 基因组学、蛋白质组学和糖组学

 

糖链参与细胞-细胞相互作用、细菌或病毒的感染和识别、癌细胞的生长和转移，可用于癌症的靶向治疗和细菌或病毒感染的预防等。2023年4月，日本拨资321亿日元，启动了为期10年的人类糖组计划（Human Glycome Atalas Project，HGA）。

 

糖链与生命活动有关，贯穿生命起源、出生、发育、衰老、死亡的生命周期的全过程；糖链还与疾病有关，糖组学对疾病的筛查、诊断、治疗、评价、验证、健康管理和预防都有重要意义。因此，糖组学可以研究人类生命过程中的各种机制（包括发病机制、诊断、治疗和预防等）（见图2）。

 

图2  糖链与细胞-细胞相互作用、感染、癌症和靶向治疗和预防有关

 

二、糖链检测方法

 

20世纪80年代，研究人员开始对糖链的分离和检测进行研究，最早采用高效液相色谱—荧光检测法（HPLC-FLD），检测速度较慢，每天约100份样本。21世纪初，开始应用DNA测序仪，用毛细管凝胶电泳（CGE-LIF）技术分析糖链，糖链检测方法快速发展。尔后又建立了自动化和数据库分析方法，糖链检测更加简便、快速、质量可控，每日可检测10000份样本（见图3）。

 

图3. 糖链检测方法

 

国内成功研发的基于荧光毛细管电泳法的寡糖链检测试剂盒——洁太司，仅需微量血清标本（2 μL血清），使用酶将糖链与蛋白分离，对糖链进行荧光标记后，通过毛细血管电泳，将不同分子量大小的糖链混合物区分开，应用糖组分析仪进行测定，得到血清标本的糖组图谱，对数据进行分析，给出判定结果（见图4）。

 

图4. 寡糖链检测试剂盒 (荧光毛细管电泳法) 洁太司检测方法

 

三、糖链检测诊断肝细胞癌

 

糖基化参与癌细胞的细胞黏附及迁移、癌细胞转移、免疫识别、信号转导和细胞凋亡，与癌症的发生发展密切相关，这直接体现在糖链的类别和数目上，因而糖链检测可用于癌症的辅助诊断。

 

乙型和丙型肝炎病毒感染或代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）等各种慢性肝病可进展为肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌（HCC），糖链变化可以实时反映肝病进展中的特征性变化，肝纤维化患者的N-糖链半乳糖基化下降，肝硬化患者的平分型N-糖链增加，而HCC患者的多分支型N-糖链和支链岩藻糖基化增加。因此，糖类检测可用于HCC的早期诊断以及显著肝纤维化和肝硬化的辅助诊断。

 

首都医科大学附属北京佑安医院、清华大学附属北京长庚医院、天津市第二医院等总共7家医院参加完成洁太司糖链检测诊断HCC的3次临床试验，总共入组3397例参与者，其中HCC患者767例。与临床或病理学诊断乙肝HCC结果进行比较，在包括健康人群、乙肝相关肝病、其他肝病和其他恶性肿瘤的3397例总入组样本中，洁太司糖链检测用于诊断HCC的灵敏度为86.44%（95%CI：83.84%~88.68%），特异性为90.04%（95%CI：88.83%~91.12%），总符合率为89.23%（95%CI：88.14%~90.22%）；在2637例乙肝相关肝病（慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化、乙肝HCC）患者中，洁太司糖链检测用于诊断HCC的灵敏度为86.44%（95%CI：83.84%~88.68%），特异性为93.69%（95%CI：92.50%~94.70%），总符合率为91.58%（95%CI：90.46%~92.58%）。

 

其中2215例患者有糖链和甲胎蛋白（AFP）检测结果，与临床或病理学诊断比较，洁太司糖链检测用于诊断HCC的灵敏度和特异性分别为86.09%（95%CI：83.37%~88.43%）（619/719）和93.85%（95%CI：92.52%~94.96%）（1404/1496）；AFP（20 ng/mL）用于诊断HCC的灵敏度和特异性分别为49.37%（95%CI：45.73%~53.02%）（355/719）和86.97%（95%CI：86.16%~88.56%）（1301/1496），糖链检测的诊断HCC显著优于AFP（见表1）。

 

 

丛敏研究员等对247例HBV相关肝病患者的血清糖链图谱进行横断面研究，40例肝纤维化患者经肝活检诊断（Ishak I-IV期），60例肝硬化患者中，10例经肝活检诊断，50例为临床诊断，HCC经腹部CT和（或）MRI诊断，包括67例早期肝细胞癌（EHCC，巴塞罗那分期为很早和早期）和80例晚期肝细胞癌（LHCC，巴塞罗那分期为中期和晚期）。研究表明，肝纤维化和肝硬化、早期和晚期HCC患者的糖链典型图谱具有明显差异（见图5）。

 

图5. 肝纤维化和肝硬化、早期HCC和晚期HCC糖链典型图谱

 

建立糖链EHCC模型，可用于HBV肝纤维化或肝硬化与EHCC的鉴别诊断（P<0.001），糖链EHCC模型对鉴别肝纤维化或肝硬化与EHCC、鉴别肝纤维化与EHCC、鉴别肝硬化与EHCC显著优于AFP [受试者工作特征曲线下面积（AUROC）分别为0.936对比0.731、0.954对比0.805和0.921对比0.698] （见图6）。

 

图6. 糖链EHCC模型鉴别HBV肝纤维化或肝硬化与EHCC

 

对67例EHCC患者进行回顾性研究，其中33例患者有临床或影像学诊断EHCC前12个月的血清标本，46例有临床或影像学诊断EHCC前6个月的血清标本，在EHCC诊断前12个月和6个月时，糖链EHCC模型对HCC的检出率分别为93.9%和93.5%，而AFP（200 ng/mL）对HCC的检出率分别为0.0%和2.2%。因此，在临床诊断EHCC之前6-12个月，应用糖链EHCC模型检出HCC的灵敏度高达90%以上，具有非常重要的临床应用价值（见表2）。

 

 

四、糖链检测诊断肝纤维化和肝硬化

 

糖链通过不同途径与蛋白质、脂质共价结合形成糖缀合物，形成胞外基质，而胞外基质的沉积是纤维化进展的表现。糖基化修饰在肝纤维化组织中增强；肝细胞、肝星状细胞缺失糖苷酶，促进肝纤维化的发生发展。

 

庄辉院士团队近期于Engineering杂志在线发表了一项研究，探索使用血清糖链标志物来评估丙氨酸转移酶（ALT）持续正常慢性乙型肝炎（CHB）患者的肝纤维化程度。研究共纳入285例ALT水平持续正常（< 40 IU/L）的CHB患者，均行肝活检，采用Ishak评分系统评估肝纤维化分期，采用DNA测序仪的荧光毛细管电泳糖分析技术（DSA-FACE）对患者的血清N-聚糖进行检测。每名受试者的血清样本中共鉴定出9个N-聚糖峰，不同纤维化程度患者的糖链典型图谱存在明显差异（见图7）。

 

图7. CHB患者不同纤维化程度的糖链典型图谱

 

采用随机森林（RF）分析的机器学习方法，构建血清N-聚糖模型，以肝活检为“金标准”，N-聚糖模型用于诊断显著肝纤维化（≥F3）和肝硬化（≥F5）的价值显著优于肝脏瞬时弹性成像检测的肝脏硬度值（LSM）、天门冬氨酸转移酶与血小板比值指数（APRI）和FIB-4指数 [AUROC分别为0.94对比0.72、0.67和0.64以及0.97对比0.73、0.76和0.79]。因此，在ALT持续正常的CHB患者中，血清N-聚糖检测有望用于鉴别肝脏有无显著肝纤维化和肝硬化（见图8）。

 

图8. 以肝活检为“金标准”，血清N-聚糖模型诊断ALT正常CHB，显著肝纤维化和肝硬化优于LSM、APRI和FIB-4

 

小 结

 

糖组学是研究糖链结构和功能的一门学科，与基因组学、蛋白组学一起构成人类3条生命链；糖链检测可早期诊断肝细胞癌，其灵敏度优于AFP；糖链检测可诊断显著肝纤维化和肝硬化，其灵敏度优于LSM、APRI和FIB-4。

 

 

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