编者按

5月7日~5月10日，2025年欧洲肝病研究学会（EASL）年会在荷兰阿姆斯特丹隆重召开，来自世界各地的肝病专家学者共聚一堂分享交流肝病领域最新研究进展。郑州大学第一临床医学院内科学传染病学梁红霞教授团队的研究入选大会壁报交流，他们创新性地利用溶酶体靶向纳米嵌合体（LYTAC）技术，结合ALK5小分子抑制剂，成功合成了新型纳米溶酶体靶向降解嵌合体MAP。本刊特对研究内容进行整理，以飨读者。

溶酶体靶向纳米嵌合体介导ALK5降解协同抑制TGF-β信号通路治疗肝纤维化的研究

Harnessing antioxidant nano-chimeras for combining targeted transforming growth factor β receptor I degradation and transforming growth factor β reduction to attenuate liver fibrosis（大会摘要号：SAT-049）

作者：郑州大学第一临床医学院内科学传染病学刘晗姝 梁红霞

背景

肝纤维化是由慢性肝损伤引起的细胞外基质（ECM）过度沉积的病理现象，ECM主要来源于活化的肝星状细胞（HSCs），因此HSCs的激活是肝纤维化发生发展的核心机制[1,2]。但目前临床上尚无被批准的特异性抗肝纤维化药物，故开发安全有效的治疗肝纤维化的新型药物具有重要意义。

HSCs主要通过转化生长因子β（TGF-β）-抑制母体对十足律蛋白的反应蛋白（Smad）2/3信号通路被驱动激活[3]。激活素受体样激酶5（ALK5）属于TGF-β Ⅰ型受体,它在TGF-β信号传递中起着至关重要的作用，其小分子抑制剂由于口服方便及可逆性抑制等优点已成为靶向TGF-β信号通路的热点药物[4,5]。但ALK5小分子抑制剂潜在的脱靶效应，以及ALK5在TGF-β刺激下代偿性上调的生理机制，均可能减弱其药效，其临床研究仍处于早期阶段[6]。故探索联合治疗方案，开发精准递送至活化HSCs的靶向TGF-β信号通路治疗体系对于缓解肝纤维化十分必要。

近年来新兴的溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）技术由细胞外目标蛋白（POI）结合元件和溶酶体靶向受体（LTR）配体组成三元复合物，通过网格蛋白介导的内吞作用导致POI内化随后被溶酶体降解[7,8]。其中，非阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR）是一种常见的LTR，在活化的HSCs表面高表达，能够介导其配体甘露糖-6-磷酸（M6P）修饰的“货物”递送至活化HSCs的溶酶体降解，故基于CI-M6PR的LYTAC可以精准靶向降解HSCs细胞膜上的致病蛋白[9,10]。目前LYTAC在抗肝纤维化领域中的应用仍是空白，因此将LYTAC技术与ALK5小分子抑制剂相结合可为治疗肝纤维化提供新思路。

在本研究中，我们首先参照文献中的方法合成PDA纳米颗粒（PDA nanoparticles，PDA NPs）[11]，并利用点击化学（Click chemistry，CC）反应将ALK5小分子抑制剂（R268712）和CI-M6PR靶向配体（M6P）偶联到抗氧化PDA纳米颗粒表面，形成新型纳米溶酶体靶向降解嵌合体，称为MAP（M6P-ALK5抑制剂-PDA）。MAP利用大小效应优先在肝组织中聚集进而实现双重功能：（1）清除肝组织内的ROS，从而减少TGF-β的产生和分泌；（2）利用修饰后的M6P对CI-M6PR的高亲和力选择性地结合活化的HSCs，然后将细胞膜上的ALK5捕获到溶酶体中进行降解。MAP通过同时降低HSCs表面的TGF-β水平和靶向降解ALK5，有效抑制HSCs内TGF-β-Smad2/3信号通路的激活，从而减少ECM的分泌，延缓肝纤维化的进展。体外和体内实验结果证实了工程化MAP的强大抗纤维化作用，这标志着溶酶体靶向降解技术在肝纤维化治疗中的应用取得了重大进展，并扩展了这一难治性疾病的潜在治疗策略。

方法和结果

01

MAP合成和表征

首先，氢核磁共振波（1H NMR）谱和碳-13核磁共振波（13C NMR）谱的结果验证了炔基-M6P和炔基-R268712的成功合成。随后电镜结果证明了合成的PDA纳米颗粒和其终产物MAP纳米颗粒均具有均匀稳定的球形介孔结构。我们使用激光纳米粒径分析仪对合成的PDA、AP、MP和MAP进行材料表征，结果表明，合成的四种纳米颗粒PDI均小于0.25。

02

MAP通过清除ROS抑制TGF-β分泌的效果评估

四种经典ROS自由基清除实验结果表明MAP能有效清除多种ROS，其抗氧化活性与未经修饰的PDA纳米颗粒无显著差异，甚至在某些情况下有所增强。与仅用H2O2处理的对照组相比，PDA和MAP纳米颗粒均显著降低了细胞内代表ROS的绿色荧光强度。随后qPCR和WB实验结果证明PDA及MAP可有效下调巨噬细胞中TGF-β1 mRNA水平、细胞内和细胞分泌的TGF-β1蛋白表达水平。

03

MAP体外药效评价和机制研究

流式细胞术和共聚焦实验结果均表明，与未经炔基-M6P修饰的纳米药物相比，经炔基-M6P修饰后的纳米药物显示出更强的细胞摄取效率及更显著的溶酶体共定位效果。体外降解实验证明当R268712与M6P的摩尔比为1：4时MAP降解ALK5效率最佳，且ALK5的降解效呈时间依赖性、可逆性和剂量依赖性，MAP降解半数ALK5的浓度为15.4 μM，最大降解效率为84.7%。使用溶酶体抑制剂氯喹证明MAP通过溶酶体途径实现ALK5降解。

04

MAP体内药效评价及机制研究

Cy5-AP和Cy5-MAP纳米颗粒均在肝脏中表现出显著的荧光信号积累，而在其他器官中仅检测到微弱信号，且Cy5-MAP处理组小鼠肝脏中的荧光强度是Cy5-AP组的1.75倍。小鼠造模和治疗结束后进行系统性疗效评估，结果表明与CCl4造模组相比，MAP的治疗明显改善了肝组织形态外观和质地，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和总胆红素（TBIL）水平明显下降。H&E染色结果表明MAP逆转了CCl4诱导的肝组织坏死，肝细胞空泡变性以及肝窦充血等现象。Masson染色结果表明MAP显著减少CCl4诱导的胶原沉积。WB和免疫组化结果表明体内纤维化标志物在MAP治疗后较CCl4造模组显著下调。qPCR和WB实验结果证实在CCl4诱导的肝纤维化小鼠体内，MAP及PDA均可明显降低肝纤维化小鼠体内升高的TGF-β1 mRNA及蛋白水平，MAP还展现出优越的体内降解ALK5的能力，并显著下调Smad2和Smad3磷酸化蛋白水平。最后H&E染色的结果证明MAP治疗后除肝脏外的主要脏器无明显病理性损伤。

结 论

1、本工作成功合成了均匀球形的PDA和MAP纳米颗粒，其均具有良好分散性。

2、MAP纳米颗粒具有强大的抗氧化能力，能够有效中和巨噬细胞内过度产生的ROS，显著减少TGF-β1的生成和分泌。

3、MAP在体外特异性地靶向活化的HSCs，通过溶酶体有效降解ALK5，且ALK5的降解效果与配体摩尔比例相关，呈时间依赖性、可逆性和剂量依赖性。

4、MAP在肝纤维化模型小鼠体内能够实现在肝脏中的高效富集和长效滞留，且具有良好的缓解肝损伤效果，通过抑制TGF-β-Smad2/3信号通路发挥抗肝纤维化的作用。

专家简介

梁红霞教授

郑州大学第一附属医院

郑州大学第一附属医院感染科主任，主任医师、医学博士、博士后、博士研究生导师。任中华医学会肝病学分会青年委员、河南省医学会肝病学会常务委员兼秘书、河南省感染病学学会常务委员、郑州市肝病委员会常务委员。主持国家自然科学基金项目1项，主持及参与省级课题多项，曾获“河南省科学技术进步二等奖”1项，“河南省医学科学技术进步二等奖”1项，获“河南省高校科技进步奖”1项。参与多个乙肝及丙肝的临床药物研究。发表SCI论文20余篇。

刘晗姝

郑州大学第一附属医院

2022级郑州大学第一附属医院内科学传染病学专业型硕士研究生

参考文献：

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[3] Crouchet E, Dachraoui M, Jühling F, et al. Targeting the liver clock improves fibrosis by restoring TGF-β signaling[J]. J Hepatol, 2025;82(1):120-133.

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[11] Peng L, Hung CT, Wang S, et al. Versatile Nanoemulsion Assembly Approach to Synthesize Functional Mesoporous Carbon Nanospheres with Tunable Pore Sizes and Architectures[J]. J Am Chem Soc, 2019;141(17):7073-7080.

（来源：《国际肝病》编辑部）

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